Multiplex génexpressziós vizsgálat, szekvenálás és fragmens analízis egyetlen készülékkel
A Beckman Coulter GenomeLab GeXP rendszerével 30 gén expresszióját lehet vizsgálni egyidejűleg multiplex módon.
Gén expressziós vizsgálatok régóta segítik azok munkáját, akik több gén együttműködését, transzkripciós faktorok hatását, szignál transzdukciós útvonalakat, vagy sok-génes tulajdonságok manifesztálódását tanulmányozzák. A humán genom feltérképezése után a microarray technika megjelenésével lehetővé vált, hogy az előbb említett sok-génes tulajdonságok megjelenésében szerepet játszó gének azonosíthatókká váljanak egy teljes genomot átölelő transzkripciós profil megállapításával.
Az elsődleges szűréssel meghatározott gének részletes vizsgálatára ma már leginkább a Real Time RT-PCR-t használják a hagyományos Northern-blott helyett. Ez a metodika ma már jól kidolgozott és jól reprodukálható. Hátránya viszont, hogy általában egy reakcióban egyetlen gén vizsgálatát teszi lehetővé.
A Beckman Coulter kifejlesztett egy olyan rendszert, ami pontosan a két említett technológia (microarray és qRT-PCR) átbocsátó képessége közötti mintaszám lefuttatására alkalmas. Egyetlen reakcióban mintegy 30 gén multiplex, kvantitativ vizsgálata valósitható meg, a qRT-PCR módszerre jellemző megbízhatósággal. Így teljes expressziós profil felvételére illetve összehasonlítására nyílik lehetőség
A rendszer teljes működéséhez szükséges reagensek nagy része, a szoftver, a számítógép és a kapilláris elektroforézis készülék a Beckman Coulter-től megvásárolható. A szintén szükséges Taq polimerázt és egy normál PCR készüléket más forrásból kell biztosítani.
A teljes eljárás az alábbi lépésekből áll:
1. Primer tervezés
Egy reakcióban 30 gén párhuzamos értékelése esetén 60 primernek kell egyszerre működnie úgy, hogy a dimerek, és a nem megfelelő PCR termékek keletkezését elkerüljük, és mindezt közel azonos hőmérsékleten végrehajtva. Elképzelhető, milyen bonyolult művelet lehet ennek megtervezése. Ezt a műveletet az eXpress Profiler nevű szoftver "eXpress Designer" modulja végzi. A primerek optimális megtervezéséhez a templát szekvenciákat nukleotid sorrenddel is beadhatjuk, de sokkal kényelmesebb csak az adott mRNS elérhetőségi számát (GenBank access number in FASTA) megadni. A program segítségével megtervezett jelöletlen oligókat megrendelhetjük a szolgáltatónktól. Ez 30 gén esetén 60 db jelöletlen oligót jelent. 
Ezek mindegyike egy ú.n. chiméra primer: 3' végükön egy génspecifikus szekvenciát tartalmaznak, amivel az mRNS-hez és az első cDNS szálhoz kapcsolódnak 5' végükön pedig egy olyan univerzális szakaszt, ami a reverz transzkripció (RT) során beépül a keletkező cDNS-be. Ez az univerzális szakasz szolgál templátként az RT reakciót követő PCR-amplifikációhoz szükséges univerzális primer párnak, melyek közül az egyik a detektáláshoz szükséges festékkel van jelölve.
2. Első cDNS szál szintézise (Reverz transzkripció)
Ebben a lépésben csak a reverz chimera primereket adjuk a templátként szolgáló total RNS-hez és a kanamycin mRNS-hez (mint belső kontroll), a reverz transzkriptáz és puffer mellett. Ennek során keletkezik az első cDNS szál, ami nagyrészt complementer az mRNS-sel, másrészt 5' végén tartalmazza az univerzális primer szekvenciáját.
3. Második cDNS szál szintézise és PCR amplifikáció
Az RT reakció egy alikvotját kiegészítjük az 5' végükön szintén univerzális, a 3' végükön génspecifikus szekvenciát hordozó forward chimera primerekkel, a Taq polimerázzal és pufferrel, és az univerzális primerpárral. Ezen kiegészítőkkel lefuttatott PCR reakció során olyan másodlagos cDNS-szakaszok keletkeznek, melyek mindkét végén a primerek által kódolt univerzális szekvenciát találunk, így.a különböző génekről keletkezett cDNS-szakaszok további amplifikációja a továbbiakban olyan, univerzális PCR primerekkel történik, melyek közül a forward primer 5' vége fluoreszcens festékkel van jelölve. A végeredmény sok-sok olyan PCR termék, melyek egyik végükön hordozzák a forward univerzális primer által bevitt festéket. A keletkezett amplifikátumok azonosítása kapilláris elektroforézissel, méret alapján történik. A primer tervezés során ugyanis a szoftver olyan priming pozíciókat tervez, hogy az egyes génekről különböző hosszúságú PCR termékek keletkezzenek, így az említett 30 gén esetén az univerzális régiókkal végződő jelölt amplifikátumok 30 csoportba oszthatók, melyek különböző hosszúságúak.
4. A keletkezett PCR termékek fragmens analízise a GeXP Analysis System-mel
A fentebb említett amplifikátumokat egy kapilláris elektroforézis alapú szekvenátor segítségével analizáljuk. Ez tulajdonképpen egy fragmens analízis, aminek a végeredménye egy kromatogram, ahol az egyes csúcsok megfelelnek a vizsgált géneknek, a mintával együtt vizsgált normalizálási, háztartási (housekeeping) géneknek és a kanamycin pozitív kontrollnak.
5. Fragmens analízis és expressziós profil megállapítása
A kapilláris elektroforézisből kapott nyers adatokat először a GeXP System Softver segítségével dolgozzuk fel. Az így nyert fragmens adatokat, csúcsmagasságokat és görbe alatti terület értékeket exportáljuk az eXpress Profiler szoftverbe. Az eXpress Analysis modul elvégzi a szükséges számításokat, mint pl.: normalizálás. Az eredmények megjelenítése az eXpress Map modullal történik, mint hőfénykép (Eisen plot) az up- and down- regulációról, relatív expressziós profil grafikon a különböző kezelések függvényében, korrelációs táblázat vagy klaszterezett adatok, ahol géncsoportokat jelölhetünk meg.
A fenti reakciók 96-lyukú PCR platekben zajlanak. Így a rendszer előnye nem csak abban rejlik, hogy akár 30 gént lehet egyetlen wellben vizsgálni, hanem abban is, hogy a kapilláris elektroforézis során 2 db 96-os plate analizálható automatikusan, így egyetlen körben, akár 192 minta, kezelés hasonlítható össze.
Egy mintához mindösszesen 25 ng total RNS-re van szükség.
További előnye a rendszernek, hogy nagyobb számú gén esetén az egy gén vizsgálatára eső költség rohamosan csökken. Ez nemcsak abból származik, hogy multiplex vizsgálatot hajtunk végre és így a fajlagos költség és munkaidő ráfordítás csökken, hanem abból is, hogy a jelölt és így drága univerzális primer génektől függetlenül minden reakcióhoz használható, így előbb-utóbb a teljes mennyiséget elhasználjuk, szemben az eddigi módszerek jelentős részében a jelölt génspecifikus oligók csak egy töredékét használjuk fel egy-egy gén vizsgálatához.
Végül még egy komoly előny. A fragmens analízishez használt kapilláris elektroforézis készülék egyben egy 8-kapillárisos szekvenáló is, amin szekvenálási feladatok mellet, SNP vizsgálatokat is végezhetünk. Az ezekhez szükséges reagensek beszerezhetőek a Beckman Coultertől. Vagyis az új készülék a szükséges reagensekkel együtt egy multifunkciós rendszer: génexpresszió analizátor és nukleinsav szekvenát