Automata DNS szekvenátor/analizátor (Beckman Coulter)
A Beckman Coulter két típusát kínálja a kapilláris elektroforézis alapú nukleinsav szekvenátoroknak, genetikai analizátoroknak.
A GenomeLab GeXP Genetic Analysis System mindkét modellje 8 db „coated" (fedett) kapillárissal rendelkezik. A kapilláris belső bevonata elsősorban a kapilláris elektroforézis legnagyobb ellenségének az elektroozmózisnak a kompenzálására hivatott. Az elektroforézis mindegyik felhasználási módban (fragmens-analízis vagy szekvenálás) a Beckman Coulter által kifejlesztett nem toxikus, linearizált poliakrilamidban (LPA) történik. A mintát PCR plate-ben kell elhelyezni. A Single Rail modellben egy plétet helyezhetünk el, míg a Dual Rail modellben kettőt.
Igen egyszerű az elektroforézis előkészítése. Első lépésként a kapillárist és a géltartó fecskendőt kell elhelyezni. Ez a lépés természetesen kimarad, amennyiben folyamatosan használjuk a készüléket. A mintatartó és a puffertartó plate-ek elhelyezése után történik a futtatás programozása. Itt adjuk meg, hogy a mintatartó 1-1 sorában lévő 8-8 minta milyen vizsgálatnak legyen alávetve. Mivel a GenomeLab GeXP készülékekben minden applikáció egyféle kapillárisban és egyféle gélben történik, így a program akár a következő is lehet: pl.: 1. sor szekvenálás, 2. sor SNP analízis, 3. sor STR analízis, stb.. A további lépéseket a készülék automatikusan elvégzi: kapilláris feltöltése géllel, egy sorban lévő minták denaturálása, mintafelvitel, futtatás, adatgyűjtés, kapilláris feltöltése újabb géllel és már jöhet is a következő sor.
A szekvenálásra a „Dye Terminátor" kémiát használja a rendszer. A négy infravörös tartományú spektrummal rendelkező Wellred festék 2 lézer diódával gerjesztett, vagyis egy lézer csak két festéket gerjeszt, így könnyebb a spektrum átfedésekből adódó nehézségek kompenzációja. További előny, hogy a lézerdióda élettartama többszöröse, míg a csereköltsége töredéke az eddigieknek.
A szekvenálás hatékonyan hajtható végre, hiszen 100 perc alatt mintegy 700 bp vizsgálható legalább 98,5 %-os biztonsággal. Nehéz templátok, mint rövid PCR termékek, G/C gazdag és poliA vagy poliT tartalmú DNS szakaszok vizsgálatára is jó eséllyel vállalkozhatunk.
Fragment analízisre a fenti festékekkel jelölt primerek használhatóak, de alternatív lehetőségként kínálkozik a Cy3, Cy5 és a Cy5.5. Ide tartozó vizsgálatok: STR genotipizálás, AFLP, tRFLP, fRFLP DNS fingerprinting, SNP typing, DNS kvantifikálás, loss of heterozygosity, microsatellit instabilitás, gén expresszió.
SNP vizsgálatokra a „primer extension assay" használható, ahol a tervezett primer pontosan a vizsgált pozíció előtt végződik. A reakció során a következő nukleotidnak megfelelően kapcsolódik a festékkel jelölt, didezoxi, terminátor nukleotid. A fragmens analízist lefuttatva az adott fragmens hossznál a detektált fluoreszcencia alapján megmondhatjuk a genotipust. Az analízis rendkívül gyors, hiszen 16 perc alatt a 8 kapillárisban összesen mintegy 80 lókusz vizsgálható.
A System Software mindegyik applikáció számára nyújt adatgyűjtési és kiértékelési lehetőségeket, így nem szükséges újabb és újabb modulok megvásárlása.
A GenomeLab GeXP tartalmaz egy másik szoftvert is: eXpress Profiler. Így a készülék alkalmas génexpressziós profilok multiplex vizsgálatára is. Egyetlen reakcióban mintegy 30 gén expressziós profilja vizsgálható kvantitatív módon.
Az expressziós rendszer teljes működéséhez szükséges reagensek nagy része Beckman Coulter-től megvásárolható. A szintén szükséges Taq polimerázt és egy normál PCR készüléket más forrásból kell biztosítani.
A teljes eljárás az alábbi lépésekből áll:
1. Primer tervezés
Egy reakcióban 30 gén párhuzamos értékelése esetén 60 primernek kell egyszerre működnie úgy, hogy a dimerek, és a nem megfelelő PCR termékek keletkezését elkerüljük, és mindezt közel azonos hőmérsékleten végrehajtva. Elképzelhető, milyen bonyolult művelet lehet ennek megtervezése. Ezt a műveletet egy erre a célra kifejlesztett eXpress Profiler nevű szoftver "eXpress Designer" modulja végzi. A primerek optimális megtervezéséhez a templát szekvenciákat nukleotid sorrenddel is beadhatjuk, de sokkal kényelmesebb csak az adott mRNS elérhetőségi számát (GenBank access number in FASTA) megadni. A program segítségével megtervezett jelöletlen oligókat megrendelhetjük a szolgáltatónktól. Ez 30 gén esetén 60 db jelöletlen oligót jelent. Ezek mindegyike egy ú.n. chiméra primer: 3' végükön egy génspecifikus szekvenciát tartalmaznak, amivel az mRNS-hez és az első cDNS szálhoz kapcsolódnak 5' végükön pedig egy olyan univerzális szakaszt, ami a reverz transzkripció (RT) során beépül a keletkező cDNS-be. Ez az univerzális szakasz szolgál templátként az RT reakciót követő PCR-amplifikációhoz szükséges univerzális primer párnak, melyek közül az egyik a detektáláshoz szükséges festékkel van jelölve.
2. Első cDNS szál szintézise (Reverz transzkripció)
Ebben a lépésben csak a reverz chimera primereket adjuk a templátként szolgáló total RNS-hez és a kanamycin mRNS-hez (mint belső kontroll), a reverz transzkriptáz és puffer mellett.
3. Második cDNS szál szintézise és PCR amplifikáció
Az RT reakció egy alikvotját kiegészítjük az 5' végükön szintén univerzális, a 3' végükön génspecifikus szekvenciát hordozó forward chimera primerekkel, a Taq polimerázzal és pufferrel, és néhány ciklust lefuttatunk. Ennek során olyan másodlagos cDNS-szakaszok keletkeznek, melyek mindkét végén a primerek által kódolt univerzális szekvenciát találunk, így.a különböző génekről keletkezett cDNS-szakaszok további amplifikációja a továbbiakban olyan, univerzális PCR primerekkel történik,, melyek közül a forward primer 5' vége fluoreszcens festékkel van jelölve.. A végeredmény sok-sok olyan PCR termék, melyek egyik végükön hordozzák a forward univerzális primer által bevitt festéket. A keletkezett amplifikátumok azonosítása elektroforézist követően méret alapján történik. A primer tervezés során ugyanis a szoftver olyan priming pozíciókat tervez, hogy az egyes génekről különböző hosszúságú PCR termékek keletkezzenek, így az említett 30 gén esetén az univerzális régiókkal végződő jelölt amplifikátumok 30 csoportba oszthatók, melyek különböző hosszúságúak.
4. A keletkezett PCR termékek fragmens analízise a GeXP Analysis System-mel
A fentebb említett amplifikátumokat egy kapilláris elektroforézis alapú szekvenátor segítségével analizáljuk. Ez tulajdonképpen egy fragmens analízis, aminek a végeredménye egy kromatogram, ahol az egyes csúcsok megfelelnek a vizsgált géneknek, a mintával együtt vizsgált normalizálási, háztartási (housekeeping) géneknek és a kanamycin pozitív kontrollnak.
5. Fragmens analízis és expressziós profil megállapítása
A kapilláris elektroforézisből kapott nyers adatokat először a GeXP System Softver segítségével dolgozzuk fel. Az így nyert fragmens adatokat, csúcsmagasságokat és görbe alatti terület értékeket exportáljuk az eXpress Profiler szoftverbe. Az eXpress Analysis modul elvégzi a szükséges számításokat, mint pl.: normalizálás. Az eredmények megjelenítése az eXpress Map modullal történik, mint hőfénykép (Eisen plot) az up- and down- regulációról, relatív expressziós profil grafikon a különböző kezelések függvényében, korrelációs táblázat vagy klaszterezett adatok, ahol géncsoportokat jelölhetünk meg.
Egy mintához mindösszesen 25 ng total RNS-re van szükség.
A GeXP rendszerek nem igényelnek különösebb rendszeres fenntartási műveleteket, mint tisztítás vagy festék mátrixok futtatása. Mindösszesen arra kell ügyelnünk, hogy a kapillárist, gélt ne hagyjuk 72 óránál hosszabb ideig használatlanul a készülékben, hanem ebben az esetben tegyük hűtőbe.