Bio-Science honlap 0

Get Adobe Flash player

Vertikális elektroforézis rendszer DGGE vizsgálatokhoz (Ingeny)

  

Hatékony DGGE rendszer az INGENY-től

A DGGE módszer (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) a kétszálú DNS egy fontos fizikai tulajdonságán, az olvadási hőmérsékleten (Tm) alapul, mely a DNS bázisösszetételétől függ. A Tm változásához akár egy bázispár cseréje is elegendő. A DGGE során az előzetesen PCR-rel felszaporított DNS poliakrilamid denaturáló grádiens gélben vándorolva részlegesen megolvad. A részlegesen felnyílt DNS darabok mobilitása nagymértékben lecsökken. Ez azonos méretű, de különböző bázisösszetételű fragmentek esetén eltérő futási magasságban történik, vagyis a módszer kiválóan alkalmas mutációk detektálására. A kémiai grádienst urea és formamid segítségével alakítjuk ki, vagy az elektroforézis irányával párhuzamosan, vagy arra merőlegesen. Adott urea/formamid koncentráció a megfelelő puffer hőmérséklettel (legtöbbször 50-65°C között) körülbelül hasonló hatású, mint a sokkal magasabb hőmérséklet denaturáló ágens nélkül. A felbontás fokozható ún. GC-clamp amplikonhoz „ragasztásával" ( az egyik primer 30-40 bázis hosszúságú G-C gazdag szakaszt is hordoz), mely magas kötési energiája révén meggátolja a teljes denaturációt az elektroforézis során.

 A holland INGENY cég által gyártott INGENYphorU-2x2 vertikális elektroforézis rendszer egyszerű és hatékony lehetőséget nyújt a DGGE-hez, mellyel gyakorlatilag a mutációk 100 %-a detektálható. Az INGENYphorU ezen túl kiválóan alkalmas rokon metodikákhoz is, úgymint CDGE (Constant Denaturing Gel Electrophoresis), SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism), TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis), HA (Heteroduplex Analysis), valamint PTT (Protein Truncation Test). Az INGENYphorU főbb részei : az elektroforézis kazetta ( mely egyben öntőforma is), az elektroforézis tank, valamint a grádiens készítő. A poliakrilamid gélöntést a kazettához tartozó távtartó egyedi kialakítása teszi egyszerűvé, és ami még ennél is fontosabb, reprodukálhatóvá. A kazettába helyezett szendvicset egy speciális U-alakú távtartó zárja le szivárgásmentesen két oldalt, illetve alul, így a megfelelő fésű behelyezése után a grádiens készítő és felhasználó által biztosított perisztaltikus pumpa segítségével elkezdődhet a gélöntés.

A polimerizációt követően a távtartót lefele nyomva szabaddá válik a gél alja az elektromos erőtér felé, így a mintabetöltést követően már futtathatjuk is mintáinkat. A kazettával két darab 28 x 18 cm gél önthető egyszerre. A 18 cm hosszú gél akár 5 különböző fragment egy sávban történő futtatását is lehetővé teszi. Több különböző fésű ( 20, 32, 38, 48well) közül választhatunk; a 48 lyukas fésű használata 8-csatornás pipettával való kompatibilitás miatt a mutáció detektálásban a high-throughput igényeket is kielégíti. Az elektródacsatlakozók korróziónak ellenálló titánötvözetből, míg a az elektródák extra erős platina-irridium ötvözetből készülnek.

Nemcsak a DGGE, hanem más módszerek esetében is a hőmérséklet kritikus paraméter. A pontos hőmérséklet szabályozása a teljes tank terjedelmében, illetve mindkét gél esetén elengedhetetlen a reprodukálható eredményekhez. A 17 liter befogadóképességű, keringetőszivattyúval és termosztált melegítővel ellátott INGENYphorU puffer/elektroforézis tank hőmérséklet-tartománya 0°C-tól 70°C -ig terjed és 0,1 °C pontossággal állítható. Természetesen mód van időbeli hőmérsékletemelésre is TGGE metodikánál. SSCP kísérletekhez - ahol a futtatás általában 4-25°C közt zajlik - a tank külső hűtőegységhez is csatlakoztatható.

További ismertetőjegyek: digitális kijelző; alacsony feszültségválasztó gomb (12V) a mintabetöltéshez, külső pufferáramlás-szabályozás és pufferleeresztő szelep.

Az INGENYphorU a biztonság tekintetében is megállja a helyét, erre példa többek között a túlmelegedés elleni védelem. A robusztus akril tankban csak akkor indulhat el az elektroforézis, ha a tank fedele a helyén van.
A DGGE-hez szükséges primertervezéshez az INGENY Java alapú szoftvert is kínál. A MeltINGENY programban a szekvencia megadásán túl beállításokat tehetünk a primerre, illetőleg a GC-szakaszra vonatkozólag. A megfelelő primer kiválasztását a program által megadott olvadási görbe is segíti. Ezen túl az INGENY humán diagnosztikai céllal egyre növekvő számban kínál mutáció detektálására kész primereket is. A tervezésben és validálásban klínikai-diagnosztikai csoportok (Belgium és Hollandia) vesznek részt, a megbízhatóságot szigorú minőségellenőrzés és részletes adatlap garantálja. A jelenleg elérhető primercsoportok a következők: CFTR; HNPCC (MLH 1, MSH 2, MSH 6); BRCA (BRCA1, BRCA2); TP53. A primerpárok 1, 4, vagy 10 nmol-os mennyiségben kaphatók.

További információk: www.ingeny.com

Utolsó frissítés: 2011.12.01