JM Modern HikaShop - шаблон joomla Видео
In
(06-1) 619-8321
IDT

IDT CRISPR megoldások (gRNS-ek, Cas enzimek, HDR donorok, enhancer-ek)

Az utóbbi években egy különösen érdekes és pontos genom szerkesztési módszert fedezték fel és kezdtek használni, a CRISPR-Cas9 rendszert (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – CRISPR; CRISPR-associated – Cas /Cas9/). Ez a rendszer a baktériumok adaptív immunitását hozza létre azáltal, hogy lehetővé teszi a külső genetikai anyag felismerését és eliminálását a sejtből.

ÁRAJÁNLATOT, INFORMÁCIÓT KÉREK!

GuideRNS-ek:

- specifikus szekvenciát tartalmazó crRNS

- tracrRNS

- a fenti két szakaszt egyben tartalmazó sgRNS

- teljesen egyedivé tehető Custom Guide RNS-ek

 

CRISPR nukleáz enzimek:

- Cas9 V3

- Cas9 HiFi V3

- Cas9 V3 (glicerin-mentes)

- Cas9-GFP

- Cas9 nickase

- dCas9

- As Cas12a (Cpf1)

- Lb Cas12a (Cpf1)

 

Enhancer-ek és kontrollok (a linken az Enhancers & controls fülön)

 

HDR donorok:

- HDR donor oligók

- HDR donor blokkok

 

Alt-R™ CRISPR-Cas9 és Cas12 rendszer: újdonság az Integrated DNA Technologies®-től!

 

A rendszer tehát a genom igen pontos és hatékony szerkesztésére alkalmas, a Cas9 endonukleáz enzimet használja fel a DNS kettős szálú törés létrehozásához. A Cas9 endonukleáz egy CRISPR RNS (crRNS) segítségével azonosítja be a target DNS szekvenciát. A CRISPR crRNS mellett egy transzaktiváló CRISPR RNS (tracrRNS) is szükséges az endonukleáz aktiválásához, és a működőképes ribonukleoprotein komplex létrejöttéhez. A natív Streptococcus pyogenes rendszer crRNS-e 42, tracRNS-e 89 bázispár hosszú, ezek együttesen szükségesek tehát a Cas9 endonukleáz megfelelő targethez irányításához és a kettős szálú DNS specifikus hasításához. A hasított DNS javítása ezután a nem homológ végek egyesítésével (non-homologous end joining - NHEJ), vagy homológia alapú rekombinációval (homology directed repair – HDR) történik, ami az eredeti szekvencia módosulását eredményezheti. 

 

Az IDT optimalizált Alt-R CRISPR továbbfejlesztett rendszere egy rövidített, 67 bázispáros tracrRNS oligonukleotidot, és egy szintén rövidített 36 bázispáros crRNS-t használ a kettősszálú DNS target Cas9 enzim általi minél pontosabb szerkesztéséhez. A kémiailag módosított crRNS tartalmaz egy 19-20 bázis hosszúságú specifikus protospacer régiót és egy 16 bázispáros, a tracrRNS-sel fúzionáló domént. A DNS-RNS komplex létrejöttéhez alapvető fontosságú még egy úgynevezett PAM (protospacer adjacent motif) szekvencia megléte is mind a target DNS-en, mind a crRNS-en.

 

Az IDT ALT-R CRISPR rendszer jellemzői és előnyei

 

Az ALT-R CRISPR rendszerre más CRISPR rendszerekhez, például a natív S. pyogenes crRNS - tracrRNS komplexhez viszonyítva jóval nagyobb target specificitás jellemző.

Az ALT-R CRISPR rendszer része az E. coli törzsben termelt, tisztított, kodon optimalizált rekombináns S. pyogenes Cas9 endonukleáz. Az enzim 1 N-terminális nukleáris lokalizációs szekvenciát (NLS), 2 C-terminális NLS-t, és C-terminális 6-His címkét tartalmaz. A 3NLS-t tartalmazó Cas9 endonukleáz az Alt-R CRISPR crRNS-sel és a tracrRNS-sel olyan ribonukleoproteint (RNP) komplexet hoz létre, ami a legtöbb target esetén nagyon magas szerkesztési hatékonyságot eredményez. Az RNP komplex használatával megoldhatóak olyan problémás esetek is, amelyek mRNS vagy DNS expressziós konstruktok használatával felmerülhetnek. Például, az Alt-R S. pyogenes Cas9 endonukleázának használatával a sejtekbe juttatott Cas9 mennyisége precízen szabályozható, és ez a nem megújuló Cas9 mennyiség így limitálni tudja az enzim működésének időtartamát is. Ezek a tényezők összességében csökkentik az off-target hatást. Ráadásul az RNP használata kiküszöböli a DNS konstruktok esetén alkalmanként előforduló genomi beépülést, és a transzfektált mRNS toxikusságának lehetőségét is. Az Alt-R CRISPR portfólió leggyakrabban igényelt tételeit ezen a linken tudja megtalálni.

Amennyiben kísérleteiben a klasszikus CRISPR reakció problémába ütközik, akkor is könnyen lehet, hogy tudunk rá megoldást! Az IDT az elmúlt években ugyanis a CRISPR technológia korlátait igyekezett ledönteni, kezdve az AT gazdag régiókban jobban használható Alt-R Cas12a (Cpf1) enzim-gRNS rendszertől a HDR hatékonyságának növelésére kifejlesztett HDR donor blokkokon át egyedi szekvenciájú Custom guideRNS-eken keresztül egészen a beépülést hatékonyabbá tevő különböző enhancer-ekig.

Példaként a különböző Cas9 enzimek tulajdonságait az alábbi ábrán láthatják:

A ribonukleoprotein sejtekbe való bejuttatása igen hatékonnyá tehető lipofekcióval vagy elektroporációval. Ez a módszer az in vitro átíródó Cas9 rendszerrel szemben nem toxikus és nem aktiválja a veleszületett immunválaszt sem. Az elektroporációs enhancer-eket itt találják az Enhancers & Controls fül alatt.

Bár számos algoritmus létezik, amelyekkel a crRNS 19–20 bázis hosszúságú protospacer szekvenciája megterveztethető, ezek közül néhány erős genomszerkesztési aktivitást eredményez. Az ALT-R CRISPR rendszerrel végzett kísérletek adatai azt mutatják, hogy a szekvencia tervezésének hiánya ellenére az optimalizált RNS-ekkel végzett genomszerkesztés a DNS targetek többségében erősen specifikus lesz.

Az ALT-R CRISPR rendszerben a Cas9 endonukleáz elsősorban az RNP részeként jut be a sejtbe, a rendszer azonban kompatibilis más forrásokból származó Cas9 enzimekkel is, például az S. pyogenes Cas9 endunukleázt stabilan expresszáló sejtek vagy DNS/mRNS konstruktok révén. A külön rendelhető Cas9 expressziós plasmid konstitutív Cas9 expressziót biztosít CMV promoter irányításával

Az ALT-R CRISPR rendszer crRNS-ének kémiai módosítása megvédi a crRNS-t a celluláris RNázok általi lebontástól, a tracrRNS kémiai módosítása pedig megnövekedett nukleáz rezisztenciát kölcsönöz a molekulának, valamint tovább javítja a target specificitást. A kémiai módosításokat a megrendelt Alt-R CRISPR crRNS oligonukleotid szekvencia automatikusan tartalmazni fogja.

A kontroll kit tartalmaz egy, a HPRT(hipoxantin foszforibozil-transzferáz) génre specifikus Alt-R CRISPR HPRT pozitív kontrol crRNS-t, és egy validált Alt-R CRISPR negatív kontrollt is. Ezen kívül a kithez tartozik a kontrol crRNS-ekkel komplementer Alt-R CRISPR tracrRNS is, valamint nukleáz mentes duplex puffer, és olyan validált PCR primerek, amik a kiválasztott organizmus megfelelő HPRTrégióira specifikusak. A kitbe tartozó PCR assay teszi ideálissá a rendszert a HPRT gén módosításának ellenőrzéshez.

 

Az IDT ALT-R HDR MEGOLDÁSAI

 

Az IDT a Homology-Directed Repair (HDR) technológiában úttörőként kifejlesztett egy olyan donorszettet, amely különböző módosításokkal és szekvenciavédelemmel már magában jelentősen megnöveli a kívánt HDR hatékonyságát, miközben minimalizálja az off-target hatást és a a nemhomológ integrációkat.

Kisebb szakaszokra, pl. pontmutációk bevitelére az Alt-R HDR Donor Oligók, míg hosszabb szekvenciákhoz az Alt-R HDR Donor Block-ok ideálisak.

A hatékonyságot tovább lehet növelni HDR enhancerekkel, az alábbi ábra ezt jól is szemlélteti:

IDTDB

 

Emellett az IDT hagyományosan kiváló online tool-jai között immár megtalálhatjuk a CRISPR kísérletek könnyítését szolgáló Alt-R CRISPR HDR design tool-t is!

 

Amennyiben felkeltettük érdeklődését, esetleg kérdése lenne, keressen minket bátran!

 

For research use only. Not for use in diagnostic procedures. Unless otherwise agreed to in writing, IDT does not intend for these products to be used in clinical applications and does not warrant their fitness or suitability for any clinical diagnostic use. Purchaser is solely responsible for all decisions regarding the use of these products and any associated regulatory or legal obligations.

 

blue down arrowForgalmazott termékeink gyártói - keressen gyártó szerint a logóra kattintva